Barnaba urodził się na Cyprze w żydowskiej rodzinie z pokolenia Lewiego. Jego właściwe imię brzmiało Józef, ale Apostołowie dali mu przydomek Barnaba. Według Klemensa Aleksandryjskiego i Euzebiusza miał on należeć do 72 uczniów Pana Jezusa. Był krewnym św. Marka Ewangelisty, dlatego św. Paweł nazywa go kuzynem Ewangelisty (Kol 4, 10). Św. Barnaba zapewne razem ze św. Pawłem przybył do Jerozolimy, aby u stóp Gamaliela, znanego rabina - uczonego żydowskiego, pogłębić swoją wiedzę w zakresie religii mojżeszowej. Dzieje Apostolskie tymi słowy wprowadzają nas w okoliczności początków jego działalności. Tak, Józef, nazwany przez Apostołów Barnabas, to znaczy Syn Pocieszenia, lewita rodem z Cypru, sprzedał ziemię, którą posiadał, a pieniądze przyniósł i złożył u stóp Apostołów (Dz 4, 36-37).
O powadze, jakiej zażywał wśród Apostołów, świadczy to, że św. Paweł po swoim nawróceniu udał się najpierw do Barnaby, by pośredniczył pomiędzy nim a Apostołami (Dz 9, 26-30). Wraz ze św. Pawłem Barnaba udał się do Antiochii, gdzie pozyskali wielką liczbę wiernych dla Chrystusa. Był to rok 42 po narodzeniu Pana Jezusa. Barnaba i Paweł swoje nauczanie kierowali najpierw do Żydów. Kiedy jednak ci ich odrzucili, poszli do pogan. Aby jednak neofitów nie zrazić, nie nakładano na nich żadnych obowiązków prawa mojżeszowego, a żądano jedynie, by dawali świadectwo Chrystusowi przez przyjęcie Chrztu świętego i życie ewangeliczne. Wieść o tym dotarła jednak do gminy jerozolimskiej, która pilnie przestrzegała prawa mojżeszowego. Barnaba po raz pierwszy wprowadził Pawła do gminy żydowskiej. Obaj Apostołowie bronili tam swojego kierunku działania odnośnie do nawróconych z pogaństwa. Ich stanowczymi przeciwnikami byli natomiast nawróceni Żydzi. Sprawę rozstrzygnął na korzyść Barnaby i Pawła św. Piotr, a poparł go św. Jakub Młodszy. Ustalono, że wolno nawracać pogan, kiedy w danym mieście Żydzi nie przyjmą nauki Chrystusa Pana, oraz że nawróconym z pogaństwa nie należy narzucać obowiązku zachowania prawa mojżeszowego (Dz 15, 1-34).
Był człowiekiem dobrym, pełnym Ducha Świętego i wiary (Dz 11, 24). Św. Barnaba zabrał ze sobą św. Marka i jako towarzysz św. Pawła udał się z nimi w pierwszą podróż misyjną na Cypr, a stamtąd do Azji Mniejszej (Dz 13, 1-14. 27). Na Cyprze dokonali nawrócenia namiestnika wyspy, Sergiusza Pawła. Kiedy w miasteczku Perge św. Paweł uzdrowił człowieka chromego, na widok tego, co uczynił Paweł, tłumy zaczęły wołać po likaońsku: Bogowie przybrali postać ludzi i zstąpili do nas. Barnabę nazwali Zeusem, a Pawła Hermesem, gdyż głównie on przemawiał. A kapłan Zeusa, który miał świątynię przed miastem, przywiódł przed bramy woły i przyniósł wieńce, i chciał z tłumem złożyć (im) ofiarę. Na wieść o tym Apostołowie Barnaba i Paweł rozdarli szaty (...) Zawiedziony tłum od entuzjazmu przeszedł do wściekłości. Pobudzeni przez Żydów z Ikonium poganie omal nie pozbawili Apostołów życia, św. Pawła ukamienowali, ale cudem wyszedł z ich rąk (Dz 14, 1-19).
Barnaba zamierzał wraz ze Pawłem udać się w drugą podróż misyjną. Doszło jednak do konfliktu, gdyż Paweł stanowczo sprzeciwił się, by w tej podróży brał udział również Marek, który w czasie pierwszej samowolnie ich opuścił. Barnaba w tej sytuacji wycofał się i powrócił z Markiem na Cypr, gdzie kontynuowali dalej swoją pracę apostolską (Dz 15, 39). Odtąd giną wszelkie informacje o Barnabie. Według podania miał on pozostać na Cyprze jako pierwszy biskup i pasterz tej wyspy. Miał także działać w Rzymie, Aleksandrii, Mediolanie. Około 60 r. na Cyprze, w mieście Salaminie, miał ponieść śmierć męczeńską przez ukamienowanie. Za cesarza Zenona w roku 488 miano odnaleźć relikwie św. Barnaby. Miał on na piersiach Ewangelię św. Mateusza, którą miał sam własnoręcznie dla swojego użytku przepisać.
Jak wielką popularnością cieszył się w pierwotnym chrześcijaństwie św. Barnaba, świadczą liczne apokryfy: Dzieje Barnaby, Ewangelia Barnaby oraz List Barnaby. Dzieje Barnaby opisują walki, jakie Apostoł musiał staczać z Żydami, którzy go wreszcie mieli spalić żywcem. Prochy jego miał zebrać ze czcią św. Marek. Dziełko powstało ok. roku 400 na Cyprze. Ewangelię Barnaby mieli napisać gnostycy. Jest wspomniana w pismach niektórych ojców apostolskich, ale jej treści bliżej nie znamy. Ciekawym dokumentem jest List Barnaby z wieku II, w którym autor poleca teksty Pisma świętego tłumaczyć alegorycznie. Teologicznie cenną jest druga część tegoż Listu, mówiąca o preegzystencji Chrystusa Pana, o tajemnicy Jego wcielenia i o dwóch drogach - światła i ciemności.
Kult św. Barnaby był już w czasach apostolskich tak wielki, że tylko jemu jednemu z uczniów Dzieje Apostolskie nadają zaszczytny tytuł Apostoła. W wieku XVI powstał zakon Regularnych Kleryków św. Pawła, założony przez św. Antoniego Marię Zaccaria, od macierzystego kościoła św. Barnaby nazywany popularnie barnabitami.
Barnaba jest patronem Florencji i Mediolanu, w którym według tradycji nauczał; czczony jest także jako orędownik podczas kłótni, sporów, smutku oraz burz gradowych. W ikonografii św. Barnaba przedstawiany jest jako starszy mężczyzna z długą brodą w tunice i płaszczu albo w szatach biskupich, czasami jako kardynał. Jego atrybutami są: ewangeliarz, zwój pergaminu, gałązka oliwna, halabarda, model kościoła.